清代官方文献和宫廷档案记载光绪帝为病死。但光绪帝在慈禧死前一日晏驾，时间过于巧合，外界对其死因历来有诸多揣测。许多野史、宫廷回忆录包括溥仪均指出光绪帝是被人下毒所害，但对凶手的推测各不相同。民国之后，据光绪帝的御医透露，皇帝生前的确身体并不非常
健康，主因是不见天日、身体欠运动、心情不佳导致饮食不正常，却也无病重之迹象。1980年，整理崇陵光绪帝遗骨时“未发现外伤及中毒迹象”，结合官方档案上的说法，认为光绪帝在生前染病已经相当严重，不但阳痿而且饥悔早泄，遗精史长达二十年，中年之后已到病入膏肓之步，自然病死一说在当时一度成为学术界主流观点。直到2008年中国官方以现代法医手法检验后才证实死于砒霜中毒。
死因之验证 2008年，在光绪帝去世一百年之际，由国家清史编纂委员会、清西陵文物
管理处、中央电视台、中国原子能
科学研究院、
北京市公安局法医检验鉴定中心等单位联合组成的“清光绪帝死因”专题研究课题组确定光绪是因为“急性肠胃型砒霜中毒”而亡。研究人员通过现代法
医学手段，对光绪遗体的头茄蚂发、遗骨、衣服及墓内外环境样品，进行了反复的检测、研究和分析。专家发现，光绪的衣领部位及头发上均沾染有高浓度的三氧化二砷（即砒霜），其袍服胃区的三氧化二砷源于尸体腐败时的体液浸蚀所致，而头发及衣领的三氧化二砷也是尸液浸蚀的遗留。常人口服砒霜60至200毫克就会中毒身亡。而仅在光绪帝部分衣物和头发上检出的砒霜总量就已高达约201毫克。
1908年(光绪三十四年)11月14日傍晚被囚禁在瀛台的38岁的光绪帝驾崩；第二天下午，统治中国近半个世纪之久的74岁的慈禧太后也断了气。因仅隔一天，其死因引起许多猜测。
“清光绪皇帝死因”研究报告会上，颇多争议的光绪死因疑案，在百年后通过一系列现代专业技术手段得以确证：光绪帝突然“升天”系急性胃肠性砒霜中毒所致。
“光绪之死”是上世纪初的重大
历史事件，关于光绪的死因却众说纷纭，成为近代史上一桩谜案。有人认为，慈禧不愿意光绪在自己死后重新掌权，派人毒死了光绪。有人说，戊戌变法时袁世凯出卖光绪，怕慈禧死后遭光绪报复，于是贿赂太监下毒。还有说是太监李莲英下的毒，因为他得悉光绪日记中说慈禧死后将诛袁世凯和他。但也有人认为光绪是身体虚弱病死。
凶手之推断 慈禧说
《崇陵传信录》和《清稗类钞》两书指出：慈禧太后病危期间，曾犹豫对光绪帝要如何处置，遂以自己不久人世的消息透露给光绪帝知道，惟其近侍回报，帝曾微露喜色，故慈禧决意自己病终前，帝须先于自己命终，以免皇帝有再度亲政、否定慈禧生前之布局的可能。
清室后裔、
书法家启功指出，其曾祖父、时任礼部尚书的溥良曾亲眼看到太监从病重的慈禧宫中传出一个盖碗，称“是老佛爷赏给万岁爷的塌喇”。“塌喇”在满语中是优酪乳之意。此前从未听说过光绪帝有任何急症大病。送后不久，就由隆裕皇后的太监小德张（张兰德）向太医院正堂宣布光绪皇帝驾崩了。随后乐寿宫才哭声四起，宣布太后已死。慈禧与光绪素有嫌隙，况且当时慈禧已处于弥留之际，此时派人给软禁中的皇帝赠食，极不寻常。启功认为，慈禧可能先于光绪帝已经病死，但秘不发丧，直到确认光绪帝死亡后才对外公布死讯。
央视主任编辑钟里满依检颤肢埋验结果及史料记载认为，慈禧自戊戌政变以后就阴谋废黜及弑害光绪，更担心光绪会在自己死后复位翻案，所以才会在病危之时下毒手。
袁世凯说
称光绪帝为袁世凯所弑者认为，袁负恩反戈，陷光绪帝于万劫不复，光绪帝在瀛台，“日书项城（指袁）名以志其愤”。袁既知光绪帝对其深恶痛绝，则不能不惧太后死而帝独生，故加以谋害（见于光绪侄、末帝溥仪所著《我的前半生》及其他）。但当时袁世凯已被开缺回籍，远在
河南安阳。且按照清宫内廷制度，任何从宫外送入御用的食物必须先经人试毒。因此即使袁有动机，也不大可能有机会对光绪帝下毒手。袁更不可能在有机会篡改清实录和脉档，制造光绪帝病死的假象。
钟里满也认为，当时除了慈禧太后外，并无其他人具备指使对皇帝下毒的能力。
李连英说
曾担任慈禧的御前女官的裕德龄在其英文版自述《瀛台泣血记》中提出，下手者应系李莲英。但此说颇不合李莲英素常“侍上以敬，待下以宽”的行迹。也无任何其他史料支持。
头发遗骨衣服保存妥善
据介绍，光绪帝坟墓(清西陵的崇陵)曾被打开，后来清理封闭，留下若干头发、遗骨和衣服等由该处妥善保存。为解开“光绪之死”这一历史谜案，从2003年开始，中央电视台、清西陵文物管理处、中国原子能科学研究院、北京市公安局法医检验鉴定中心等单位组成了“清光绪帝死因”专题研究课题组。同时，这一研究也被国家清史编纂委员会纳入《国家清史纂修工程重大学术问题研究专项课题》。
据介绍，在不能开棺直验且时隔久远、检材条件很差等不利因素下，专家们历时五年，由光绪帝发砷入手，利用“中子活化”、“X射线荧光分析”“原子荧光光度”等一系列现代专业技术手段，通过开展对比、模拟实验、双向图例等工作，对清西陵文物管理处提供的光绪遗体的头发、遗骨、衣服以及墓内外环境样品进行了反复的检测、研究和缜密的分析。
经科学测算，光绪的头发截段和衣物上含有剧毒的三氧化二砷即砒霜，而其腐败尸体仅沾染在部分衣物和头发上的砒霜总量就已高达约201毫克。
体内砒霜量大于致死量
由国家清史编纂委员会主任戴逸教授等13位专家联合撰写的《清光绪帝死因研究工作报告》称，根据相关研究，常人口服砒霜60至200毫克就会中毒身亡。光绪帝摄入体内的砒霜总量明显大于致死量。其胃腹部衣物上的砷是其含毒尸体腐败后直接侵蚀遗留所致，而其衣领部位及头发上的大量砷，则由其腐败尸体溢流侵蚀所致。
中央电视台主任编辑钟里满以光绪帝临终前参与诊治的医生亲笔回忆录及搜集到的军机大臣的日记等为依据，进一步确定了光绪帝属急性胃肠性砒霜中毒而亡这一结论。
2008年11月14日是光绪帝去世一百周年，“光绪死因”在此时得以确证，别具历史意义。但关于毒死光绪的凶手，还尚待进一步研究论证。
有人说是袁世凯害死的有人说是慈禧害死的虽然说是慈禧害死的占大多数但我想听最正确的答案最好是专业的
慈禧
《崇陵传信录》和《清稗类钞》两书指出：慈禧太后病危期间，曾犹豫对光绪帝要如何处置，遂以自己不久人世的消息透露给光绪帝知兄纯道，惟其近侍回报，帝曾微露喜色，故慈禧决意自己病终前，帝须先于自己命终，以免皇帝有再度亲政、否定慈禧生前之布局的可能。
称光绪帝为袁世凯所弑者，以袁负恩反戈，陷帝于万劫不复，帝在瀛台，“日书项城（指袁）名以志其愤”。袁既知帝衔之者深，则不早历能不惧太后死而帝独生，故加以谋害（见于光绪侄、末帝溥仪所著《我的前半生》及其他）。《瀛台泣血记》以为下羡睁咐手者系李莲英，颇不合李莲英素常“侍上以敬，待下以宽”的行迹。
所以是袁世凯害死光绪帝的。